3 Möglichkeiten, die Gram-Färbungsmethode durchzuführen

2024 Autor: Jason Gerald | [email protected]. Zuletzt bearbeitet: 2023-12-16 11:03

Die Gramfärbung ist eine schnelle Technik und wird verwendet, um das Vorhandensein von Bakterien in einer Gewebeprobe zu erkennen und die Bakterien anhand der chemischen und physikalischen Eigenschaften ihrer Zellwände als grampositiv oder gramnegativ zu klassifizieren. Die Gramfärbung wird fast immer als erster Schritt bei der Diagnose einer bakteriellen Infektion verwendet.

Diese Färbetechnik ist nach dem dänischen Wissenschaftler Hans Christian Gram (1853 - 1938) benannt, der die Technik 1882 entwickelt und 1884 als Technik zur Unterscheidung zweier Bakterienarten mit ähnlichen klinischen Symptomen veröffentlicht hat: Streptococcus pneumoniae (auch bekannt als Streptococcus pneumoniae), Pneumokokken) und das Bakterium Klebsiella pneumoniae.

Schritt

Methode 1 von 3: Vorbereiten des Objektträgers

Schritt 1. Bereiten Sie sich auf die Arbeit im Labor vor

Tragen Sie Handschuhe und ein langes Haargummi, um eine bakterielle Kontamination der zu testenden Probe zu vermeiden. Reinigen Sie den Arbeitsbereich unter einer Abzugshaube oder in einem anderen gut belüfteten Bereich. Überprüfen Sie den Bunsenbrenner und vergewissern Sie sich, dass das Mikroskop ordnungsgemäß funktioniert, bevor Sie beginnen.

Schritt 2. Sterilisieren Sie den Objektträger aus Mikroskopglas

Wenn der Objektträger verschmutzt ist, waschen Sie ihn mit Seifenlauge aus, um Öl und Schmutz zu entfernen. Reinigen Sie die Objektträger mit Ethanol, Glasreiniger oder einer anderen von Ihrem Labor verwendeten Methode.

Schritt 3. Legen Sie die Probe auf den Objektträger

Sie können die Gram-Färbungstechnik verwenden, um Bakterien in einer medizinischen Probe oder einer Bakterienkultur, die in einer Petrischale wächst, zu identifizieren. Für beste Ergebnisse verwenden Sie Gram-Färbung auf dünnen Strichen der Probe. Es ist ratsam, Proben zu verwenden, die weniger als 24 Stunden alt sind, da ältere Bakterien ihre Zellwände beschädigt haben und möglicherweise nicht auf die Gram-Färbung ansprechen.

Wenn Sie eine Gewebeprobe verwenden, geben Sie 1-2 Tropfen auf einen Glasobjektträger. Gleichmäßig auf dem Objektträger verteilen, um eine dünne Schicht der Probenstreuung zu bilden, indem Sie ihn mit dem Rand des anderen sterilen Glasobjektträgers schieben. Lassen Sie es trocknen, bevor Sie den nächsten Schritt ausführen.
Wenn Sie Bakterien aus einer Petrischale entnehmen, sterilisieren Sie die Impföse in einem Bunsenbrenner, bis sie glüht, und lassen Sie sie dann abkühlen. Verwenden Sie die Schlaufe, um steriles Wasser auf den Objektträger zu tropfen, sterilisieren Sie ihn und kühlen Sie ihn erneut ab, bevor Sie ihn verwenden, um eine kleine Bakterienprobe zu entnehmen. Danach vorsichtig umrühren.
Die in der Brühe hergestellten Bakterien müssen erneut mit einem Vortexer gerührt und dann wie oben mit der Impföse ohne Wasserzugabe entnommen werden.
Wenn Sie eine Tupferprobe haben (normalerweise mit einem kleinen Baumwollstiel), berühren und drehen Sie den Tupfer vorsichtig über den Objektträger.

Schritt 4. Eine leicht hohe Temperatur kann einen guten Abstrich machen

Die Hitze hält die Bakterien auf dem Objektträger, sodass sie sich während des Färbevorgangs nicht so leicht auflösen. Klopfen Sie die Rutsche zwei- bis dreimal schnell über einen Bunsenbrenner oder erhitzen Sie die Rutsche über einer elektrischen Rutschenheizung. Nicht überhitzen, die Probe kann beschädigt werden. Wenn Sie einen Bunsenbrenner verwenden, sollte es eine kleine, aber blaue Flamme anstelle einer großen orangefarbenen Flamme sein.

Alternativ kann auch ein Abstrich mit Methanol gemacht werden, indem man 1-2 Tropfen Methanol zu einem trockenen Abstrich hinzufügt und das restliche Methanol auf dem Objektträger trocknet, indem man es an der Luft belässt. Diese Technik minimiert Zellschäden und liefert einen sauberen Bildhintergrund

Schritt 5. Positionieren Sie den Objektträger über dem Farbtablett

Färbetabletts bestehen aus Metall-, Glas- oder flachen Kunststoffplatten mit einem weichen Netzfutter auf der Oberseite. Legen Sie die Objektträger auf diese Netze, damit die Flüssigkeit, die Sie verwenden, in die Schale abgelassen werden kann.

Wenn Sie kein Maltablett haben, können Sie einen Objektträger auf eine Plastikschale legen, um Eiswürfel zu drucken

Methode 2 von 3: Gram-Färbungsprozess

Schritt 1. Gießen Sie die kristallviolette Flüssigkeit über den Ausstrich

Besprühen Sie eine Bakterienprobe mit einer Pipette mit ein paar Tropfen Kristallviolett-Farbstoff, auch Gentianaviolett genannt. Lassen Sie es für 30-60 Sekunden. Kristallviolett (KV) trennt sich in wässriger Lösung in KV+ und Chlorid (Cl-) Ionen. Diese Ionen dringen in die Zellwände und Zellmembranen von grampositiven und gramnegativen Bakterien ein. Das KV+-Ion interagiert mit den negativ geladenen Komponenten der Bakterienzellen und verleiht den Zellen eine violette Farbe.

Viele Labore verwenden Kristallviolett "Hucker", das Ammoniumoxalat enthält, um Ausfällungen zu verhindern

Schritt 2. Spülen Sie das Crystal Violett vorsichtig aus

Kippen Sie den Objektträger und verwenden Sie eine Waschflasche, um einen kleinen Strahl destillierten oder Leitungswassers über den Objektträger zu sprühen. Wasser sollte über die Oberfläche des Abstrichs herunterlaufen und nicht direkt auf den Abstrich gesprüht werden. Nicht zu stark ausspülen. Es kann Flecken in Gram-positiven Bakterien entfernen.

Schritt 3. Spülen Sie den Abstrich mit Jod und spülen Sie ihn dann aus

Verwenden Sie eine Pipette, um den Ausstrich mit Jod zu spülen. Lassen Sie es mindestens 60 Sekunden einwirken und spülen Sie es dann sorgfältig wie oben beschrieben aus. Jod in Form eines negativ geladenen Ions interagiert mit KV+, um einen großen Verbindungskomplex zwischen Kristallviolett und Jod zu bilden (CV-I-Verbindungskomplex.).) in den inneren und äußeren Schichten der Zelle. Dieser Komplex von Verbindungen behält die violette Farbe des Kristallvioletts im Inneren der Zelle an den gefärbten Stellen.

Jod ist eine ätzende Substanz. Einatmen, Verschlucken oder Kontakt mit der Haut vermeiden

Schritt 4. Füge Farbbleiche hinzu und spüle sie dann schnell ab

Für diesen wichtigen Schritt, der sorgfältig getimt werden muss, wird in der Regel eine 1:1-Mischung aus Aceton und Ethanol verwendet. Positionieren Sie den Objektträger in einem bestimmten Winkel und fügen Sie dann Farbbleiche hinzu, bis im Spülwasser kein Violett mehr sichtbar ist. Dies dauert normalerweise weniger als 10 Sekunden oder sogar noch weniger Zeit, wenn das Bleichmittel eine hohe Acetonkonzentration enthält. Stoppen Sie diesen Schritt sofort, da der Farbstoff sonst auch Kristallviolett aus den grampositiven und negativen Zellen auslaugt und der Färbevorgang wiederholt werden muss. Spülen Sie überschüssiges Farbbleichmittel sofort mit der vorherigen Technik ab.

Als Ersatz kann reines Aceton (95%+) verwendet werden. Je mehr Aceton Sie verwenden, desto schneller wirkt das Bleichmittel, daher müssen Sie mehr auf das Timing achten.
Wenn Sie die Zeit für diesen Schritt nicht im Auge behalten können, fügen Sie tropfenweise Farbbleiche hinzu.

Schritt 5. Streuen Sie den Gegenfarbstoff über den Ausstrich und spülen Sie ihn dann aus

Eine Gegenfärbung, meist Safranin oder Fuchsin, wird verwendet, um den Kontrast zwischen gramnegativen und grampositiven Bakterien zu erhöhen, indem entfärbte (entfärbte) Bakterien, d.h. gramnegative Bakterien, rosa oder rot gefärbt werden. Mindestens 45 Sekunden einwirken lassen, dann spülen.

Fuchsin färbt viele gramnegative Bakterien wie Haemophilus spp und Legionella spp intensiv an. Diese Methode ist gut für Anfänger

Schritt 6. Trocknen Sie den Objektträger

Sie können sie zum Trocknen an der Luft trocknen oder mit saugfähigem Papier trocknen, das für diesen Zweck verkauft wird. Der Gram-Färbungsprozess ist abgeschlossen.

Methode 3 von 3: Überprüfen der Färbeergebnisse

Schritt 1. Bereiten Sie das Lichtmikroskop vor

Legen Sie den Objektträger unter das Mikroskop. Bakterien variieren stark in der Größe, so dass die erforderliche Gesamtvergrößerung von 400x bis 1000x variiert. Für ein schärferes Bild wird ein Objektiv mit Immersionsöl empfohlen. Tropfen Sie das Immersionsöl auf den Objektträger und vermeiden Sie Bewegungen während des Tropfens, um die Bildung von Blasen zu vermeiden Bewegen Sie den Mikroskopobjektivgriff so, dass die Objektivlinse einrastet und das Öl berührt.

Ölimmersion kann nur bei speziell entwickelten Linsen verwendet werden, nicht bei "trockenen" Linsen

Schritt 2. Versuchen Sie, grampositive und gramnegative Bakterien zu identifizieren

Untersuchen Sie den Objektträger unter einem Lichtmikroskop. Gram-positive Bakterien erscheinen violett, weil das Kristallviolett in der dicken Zellwand eingeschlossen ist. Gram-negative Bakterien haben eine rosa oder rote Farbe, weil das Kristallviolett durch die dünnen Zellwände ausgespült wird, wo der rosa Gegenfarbstoff eindringt.

Wenn die Probe zu dick ist, kann das Ergebnis falsch positiv sein. Färben Sie eine neue Probe, wenn sie alle grampositiven Bakterien zeigt, um sicherzustellen, dass das Ergebnis korrekt ist.
Wenn Sie zu viel Farbbleiche verwenden, kann das Ergebnis falsch negativ sein. Färben Sie eine neue Probe, wenn sie alle gramnegativen Bakterien zeigt, um sicherzustellen, dass das Ergebnis korrekt ist.

Schritt 3. Vergleichen Sie die angezeigten Ergebnisse mit dem Referenzbild

Wenn Sie nicht wissen, wie Bakterien aussehen, studieren Sie die Sammlung von Referenzbildern, die normalerweise nach Form und Gram-Färbung sortiert sind. Sie können auch Online-Datenbanken unter [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos und vielen anderen Online-Sites einsehen. Um die Identifizierung zu erleichtern, sind unten Beispiele für Bakterien, die häufig vorkommen oder für die Diagnose wichtig sind, klassifiziert nach ihrem Gram-Status und ihrer Form.

Schritt 4. Identifizieren Sie grampositive Bakterien anhand ihrer Form

Bakterien werden weiter nach ihrer Form unter dem Mikroskop klassifiziert, am häufigsten als Kokken (kugelförmig) oder Stäbchen (zylindrisch). Hier sind einige Beispiele für grampositive Bakterien (violett) nach ihrer Form:

Gram positive Kokken normalerweise Staphylokokken (bedeutet Gruppenkokken) oder Streptokokken (bedeutet Kettenkokken).
' Gram - positive Stäbchen wie Bacillus, Clostridium, Corynebacterium und Listeria. Die Stäbchenbakterien Actinomyces spp. haben normalerweise Äste oder Filamente.

Schritt 5. Identifizieren Sie gramnegative Bakterien

Gram-negative Bakterien (rosa Farbe) werden oft in drei Gruppen eingeteilt. Kokken sind kugelförmig, Stäbchen sind lang und dünn, während Kokkenstäbchen dazwischen liegen.

Gram negative Kokken Am häufigsten ist Neisseria spp.
Gramnegative Stäbchen B. E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas und viele andere. Vibrio cholerae kann als normaler Stängel oder als gebogener Stängel angesehen werden.
Gram-negative „kokkoide“(oder „coccobacilli“) Stäbchenbakterien B. Bordetella, Brucella, Haemophilus und Pasteurella

Schritt 6. Prüfen Sie sorgfältig, ob die Ergebnisse gemischt sind

Einige Bakterien sind aufgrund der Sprödigkeit oder der wachsartigen Beschaffenheit ihrer Zellwände schwer genau zu färben. Diese Bakterien können eine Mischung aus Lila oder Pink in derselben Zelle oder zwischen verschiedenen Zellen in demselben Abstrich aufweisen. Bakterienproben, die älter als 24 Stunden sind, können dieses Problem zeigen, aber es gibt auch einige Bakterienarten, die in jedem Probenalter schwer zu färben sind. Diese Bakterien erfordern speziellere Tests zur Identifizierung, wie z. B. säurefeste Färbung, Beobachtung in Bakterienkulturen, TSI-Kulturmedien oder genetische Tests.

Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium und Propionibacterium spp. alle sind grampositive Bakterien, aber oft nicht deutlich gefärbt.
Kleine, schlanke Bakterien wie Treponema, Chlamydia und Rickettsia spp. schwer nach der Gram-Methode zu färben.

Schritt 7. Entsorgen Sie alle verbleibenden Verbrauchsmaterialien und Geräte

Dieses Entsorgungsverfahren ist von Labor zu Labor unterschiedlich und hängt von den verwendeten Materialien ab. Typischerweise wird die Flüssigkeit in der Färbeschale in als Sondermüll gekennzeichneten Flaschen entsorgt. Objektträger in 10 % Bleichmittellösung einweichen und dann in einem durchstichsicheren Behälter entsorgen.

Tipps

Denken Sie daran, dass die Ergebnisse der Gram-Färbung nur dann gut sind, wenn die Probe gut ist. Es ist wichtig, die Patienten zu informieren, damit sie eine gute Probe liefern können (z. B. den Unterschied zwischen Spucken und einem tiefen Husten, um eine Sputumprobe zu erhalten).
Als Farbbleichmittel reagiert Ethanol langsamer als Aceton.
Halten Sie sich an die üblichen Laborvorschriften, um die Sicherheit zu gewährleisten.
Verwenden Sie zum Üben einen Wangenabstrich, da dieser sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterien enthält. Wenn Sie nur eine Bakterienart sehen, verwenden Sie möglicherweise zu wenig oder zu viel Bleichmittel.
Sie können Holzklammern verwenden, um die Folie zu sichern.

Warnung

Aceton und Ethanol sind brennbare Stoffe. Das Aceton entfernt das Öl von deinen Händen und erleichtert deiner Haut die Aufnahme anderer Chemikalien. Tragen Sie Handschuhe und verwenden Sie diese mit Vorsicht.
Lassen Sie den Ausstrich nicht trocknen, bevor Sie den Gram-Fleck oder die Gegenfärbung abspülen.